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如何控制好數字PCR儀的溫度問(wèn)題？看完你就知道了

更新時(shí)間：2024-07-09瀏覽：1432次
　　對普通PCR儀來(lái)說(shuō)，溫度控制指標主要是指溫度的準確性、均勻性、以及升降溫速度，對數字PCR儀來(lái)說(shuō)，除了溫度的準確性和均勻性、升降溫速度以外，還必須考慮儀器在梯度模式和標準模式下是否具有同樣的溫度特性。
　　溫度的準確性是指樣品孔溫度與設定溫度的一致性，它直接關(guān)系到實(shí)驗的成敗。如果排除樣品加入過(guò)程中的問(wèn)題，對于PCR反應而言較重要的莫過(guò)于溫度控制的準確性，由于PCR是一個(gè)幾何級數擴增的過(guò)程，擴增過(guò)程中退火溫度的細微變化會(huì )被放大而直接影響結果，不論是變性、退火還是延伸都需要準確控制溫度，對退火溫度而言溫控顯的尤為重要，有時(shí)1度甚至0.5度的差異也能決定實(shí)驗的成功與失敗，所謂差之毫厘，謬之千里。因而對PCR擴增儀而言溫度控制就意味著(zhù)質(zhì)量。
　　溫度的均勻性是指樣品孔間的溫度差異，它關(guān)系到在不同樣品孔進(jìn)行反應結果的一致性。我們在實(shí)驗中發(fā)現有時(shí)用同樣的樣品，同樣的PCR反應程序，結果竟然差異非常明顯，或許就是因為不同位置的溫度不均一性所致。一些使用過(guò)早期PCR儀，腦子格外靈光的研究人員偏愛(ài)使用PCR儀中間某幾個(gè)固定的孔，就是因為過(guò)往反復的教訓和認真的思索得出了這樣的結論，數字PCR儀的溫度均勻性不好，特別是外周的樣品孔情況更差，很有可能影響實(shí)驗結果——即“位置的邊緣效應”會(huì )影響結果的可重復性。
　　溫度控制除了均勻性，還有一個(gè)廠(chǎng)家喜歡大力宣傳的指標——升降溫的速度。更快的升降溫速度，可以縮短反應進(jìn)行的時(shí)間，而且縮短了可能的非特異性結合、反應的時(shí)間，能提高PCR反應煌特異性。因此從本質(zhì)而言溫控方式就從以前相對穩定耐用的機械式轉向了升降溫更快速的半導體。除了機械本身的原因，影響升降溫速度的還有制作承托樣品管的基座模塊的材料的導熱性。
　　作為用戶(hù)來(lái)說(shuō)，當然更愿意選擇升降溫速度快的，這就像汽車(chē)上好看的表面配置一樣容易看到，而內在的穩定性和耐用性往往是看不到的而容易被忽略。必須注意到，儀器的升降溫速度和樣品管中的樣品的升降溫速度并非同一回事，因為樣品管與基座接觸的緊密性、導熱性、鄰近樣品管的相互影響都會(huì )影響樣品的實(shí)際升降溫速度。
 

　　現在的PCR儀一般具有兩種溫控模式，即模塊溫控模式和反應管溫控模式）。在模塊溫控模式下，機器根據探se器直接探se的溫控模塊（即承載樣品的金屬臺）的溫度進(jìn)行控制，這種模式適用于長(cháng)時(shí)間的靜態(tài)孵育（如連接、酶切、去磷酸化等）。反應管溫控模式實(shí)際上是一種模擬試管/PCR板的溫控模式，根據探se器所探測到的溫控模塊的溫度由計算機計算出管內/PCR板孔內樣品液的溫度來(lái)進(jìn)行控制。一般說(shuō)來(lái)，試管溫控更為準確，因為管內樣品的溫度無(wú)法與溫控模塊同時(shí)達到預設溫度。特別是PCR反應中的孵育過(guò)程一般都很短暫（30秒或更短），如果采用只有模塊溫控模式的話(huà)，反應混合物孵育的時(shí)間與程序設定的時(shí)間會(huì )有相當大的差距。而反應管控制的算法能自動(dòng)補償時(shí)間，而且適合各種類(lèi)型的反應管，確保反應混俁物按照程序設定的時(shí)間維持預設溫度。
　　有的數字PCR儀廠(chǎng)家推出了另一種溫控方式；熱敏電極溫控模式。該方法將一個(gè)熱敏電極插入一個(gè)專(zhuān)門(mén)的測量管中（管中裝有礦物油），反應進(jìn)行時(shí)，將該測量管插入溫控模塊的樣品進(jìn)行檢測。他們認為通過(guò)此途徑可以監測反應管內樣品的實(shí)際溫度，但這種方法未免有些華而不實(shí)：（1）測量管中礦物油的溫度變化與實(shí)際反應樣品的溫度變化未必一致；（2）因為測量管必須占用一個(gè)樣品孔，所以使用該溫控方式時(shí)就無(wú)法使用96孔PCR板作實(shí)驗。

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