微滴式數字PCR儀退火溫度設置得太低可能導致非特異性PCR產(chǎn)物的擴增；退火溫度過(guò)高可能會(huì )降低PCR擴增效率，降低目標產(chǎn)物的產(chǎn)量。

 

　　微滴式數字PCR儀理想的退火溫度跟多個(gè)因素有關(guān)。要找到理想的Ta溫度，需要嘗試不同的溫度下重復測試相同的反應體系，這需要耗費更多時(shí)間和試劑耗材。

 

　　其實(shí)與經(jīng)典PCR反應一樣，使用具有溫度梯度功能的熱循環(huán)儀可以很容易地確定微滴式數字PCR反應體系理想的退火溫度，在一次實(shí)驗中即可同時(shí)測試8個(gè)不同退火溫度，以篩選出理想的溫度條件。

 

　　所謂溫度梯度，即在標準的96孔PCR儀中，各行/列在同一個(gè)溫度步驟中產(chǎn)生不同的溫度。在一次運行中即可考察不同溫度對PCR擴增效果的影響，極大地減少實(shí)驗次數，避免重復實(shí)驗產(chǎn)生的不確定因素造成的影響。

 

　　對于某些難度更大的稀有突變檢測實(shí)驗中，由于野生型背景的干擾以及引物探針設計困難，很可能出現非特異性擴增。這時(shí)ddPCR體系的退火溫度不僅要確保陽(yáng)性微滴和陰性微滴的區分，還要確保僅發(fā)生非特異性的微滴與特異性擴增的微滴明確分開(kāi)。

 

　　在沒(méi)有溫度梯度功能加持的情況下，相同的數字PCR體系優(yōu)化和構建可能需要經(jīng)過(guò)十數次重復實(shí)驗來(lái)測試不同退火溫度條件下的實(shí)驗效果。此外也需要指出，并非所有的數字PCR技術(shù)都能通過(guò)溫度梯度的方式優(yōu)化檢測體系，目前僅兼容標準PCR熱循環(huán)儀的數字PCR平臺才能使用溫度梯度熱循環(huán)程序。溫度梯度功能是快速優(yōu)化、構建數字PCR反應體系的利器，能大大減少體系優(yōu)化階段數字PCR試劑耗材的額外消耗，縮短工作時(shí)間，快速取得理想的實(shí)驗結果。